Probe adalah sekuens
nukleotida single strand pendek
(kira-kira 15-32
bp) yang komplemen dengan DNA target yang biasa digunakan untuk mendeteksi dan
menganalisa keberadaan penyakit yang menginfeksi tubuh kita. Probe adalah agen
yang dimasukkan kedalam sebuah medium untuk mendapatkan informasi tentang
struktur maupun substansi tertentu. Probe memungkinkan kita untuk
memvisualisasikan struktur DNA dan juga mendeteksi kelainan-kelainan yang ada
pada suatu DNA. Probe dapat ditempeli zat radioaktif ataupun zat-zat fluorescence yang digunakan untuk
menandai DNA target yang diinginkan. Penggunaan probe atau oligonukleotida
pendek ber-radioaktif atau ber-
fluorescence berguna dalam teknik FISH, teknik pendeteksian DNA target
dengan menempelkan probe yang komplemen dan di deteksi langsung pada sampel
tersebut.
Probe yang baik harus
mengandung 45-60 % nukleotida G dan C dan hanya sepanjang 15-32 bp. Hal ini dilakukan
untuk menjaga kestabilan probe tersebut.
Selain itu, probe ini juga harus spesifik dan komplemen hanya terhadap DNA
target, dan sebisa mungkin tidak saling komplemen dengan probe itu sendiri
ataupun membentuk struktur sekunder. Apabila probe saling berkomplemen, akan
menyebabkan mispriming; dan apabila probe kurang spesifik, akan menyebabkan
bukan hanya DNA target yang akan terdeteksi.
Mekanisme
pembuatan probe untuk mendeteksi mutasi gen MLH1 pada kanker HNPCC-2:
1.
Mencari
gen penyebab kanker HNPCC-2 dan ditemukan bahwa penyebabnya adalah mutasi pada
gen MLH-1.
2.
Mendeteksi
adanya mutasi pada gen ataupun kodon pada MLH-1 yang menyebabkan kanker
HNPCC-2, ditemukan adanya mutasi berupa delesi kodon 576-632 yang menyebabkan
frameshift pada transcription varian 1 gen MLH-1.
3.
Mencari
sekuens gen MLH-1 transcript variant 1 yang telah termutasi kemudian mengambil
32 nukleotida secara acak yang memiliki bagian spesifik yang telah termutasi.
4.
Mencocokan
sekuens yang telah dipilih dengan melakukan BLAST sampai perbedaan
nukleotidanya dinilai cukup besar kurang lebih > 6 basa.
5.
Melakukan
komplemen dan reverse dari sekuens MLH-1 terdelesi yang telah dipilih untuk
membuat probe.
6.
Menentukan
reporter yang cocok untuk mengenali gen termutasi, dari pertimbangan beberapa
faktor maka kami memutuskan memakai metode FISH dengan fluorescence.
Salah satu aplikasi
teknik FISH adalah untuk pendeteksian secara langsung sel yang telah positif
sel kanker atau sel normal. Beberapa jenis kanker berasal dari sel normal yang
mengalami mutasi pada suatu sekuens gen tertentu. Mutasi ini bisa berupa
subtitusi,insersi,maupun delesi, yang mengakibatkan perubahan asam amino yang
ditranslasinya.
HNPCC adalah salah
satu jenis kanker yang dapat dideteksi dengan teknik FISH ini. HNPCC atau (Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer)
adalah kanker pada usus dan rektum yang menurun dalam garis keturunan manusia.
Terdapat berbagai type pada kanker ini, salah satunya adalah HNPCC2 atau HNPCC
tipe 2, yang diakibatkan adanya mutasi pada gen MLH1. Salah satu bentuk mutasi
ini berupa delesi pada kodon 578 sampai 632 pada gen MLH1, mengakibatkan
hilangnya 1 ekson yang dapat ditranslasi. Mutasi ini terjadi pada salah satu
garis keturunan Finnish (Finlandia).
HNPCC tipe 2 dengan mutasi ini terjadi pada kromosom nomor 3 pada manusia (3p23-p21.3)
pada sekuens gen MLH1 transcript variant 1 yang sepanjang 2kb .
Sebagian
urutan sekuens DNA dari gen MLH 1
pada kromosom nomor 3 adalah sebagai berikut:
5’-
taacctcact agtgttttga gtctccagga agaaattaat gagcagggac atgaggttct
ccgggagatg ttgcataacc actccttcgt gggctgtgtg aatcctcagt gggccttggc acagcatcaa
accaagttat accttctcaa caccaccaag cttagtgaag aactgttcta ccagatactc atttatgatt ttgccaattt tggtgttctc aggttatcgg -3’
Bagian yang berwarna
merah adalah bagian yang terdelesi (termutasi), sedangkan yang berwarna hijau
adalah sekuens yang akan digunakan sebagai
probe. Urutan probe yang akan digunakan tersebut mengikuti
langkah-langkah berikut
Sekuens termutasi 32 nukleotida:
5’
ctagtgttttgagtctccaggaagattttgcc 3’
Komplemen sekuens DNA termutasi:
3’ gatcacaaaactcagaggtccttctaaaacgg
5’
Sekuens Probe:
5’
ggcaaaatcttcctggagactcaaaacactag 3’
Digunakan desain probe
demikian karena sekuens DNA ini merupakan hasil delesi atau mutasi dari sekuens
DNA normal sehingga ketika probe ini menempel pada sekuens DNA target atau sekuens
DNA termutasi, maka keberadaan sel termutasi akan terdeteksi. Pada saat
penentuan desain probe, kami melakukan BLAST dengan hasil dimana probe yang
kami buat mempunyai ketidaksamaan lebih dari 6 basa dengan sekuens DNA bukan
target. Hasil BLAST menunjukkan maksimal hanya 78% dari 32bp probe yang
memiliki kesamaan dengan DNA bukan target
(7-8bp tidak sama).
Sekuens probe ini didesain
sepanjang 32 basa nukleotida, ini disebabkan karena probe dibuat agar dapat
menempel pada DNA target. Tetapi masih ada kemungkinan probe dapat menempel
pada sekuens DNA lain selain DNA target. Maka dari itu pada saat pemberian
probe pada sel, suhu annealing-nya
harus dinaikkan. Suhu yang lebih tinggi melemahkan ikatan hidrogen dari DNA
bukan target dengan probe.
Probe didesain
menggunakan reporter fluorescence
(FISH). Keuntungan- keuntungan dari penggunaan fluorescence ini adalah tidak membahayakan peneliti, dapat lebih
cepat dalam mendeteksi lokasi gen atau DNA, memiliki resolusi yang tinggi, dan
sentitif. ………. Selain itu penelitian untuk deteksi mutasi gen MLH1 untuk kanker
HNPCC2 ini telah banyak menggunakan teknik FISH (Fluorescence In-Situ Hibridization),dan dapat diperoleh hasil yang
cukup baik.
Untuk mendeteksi keberadaan gen
mutan digunakkan metode FISH
(fluorescent in-situ hybridization ). Alasan digunakkannya metode pewarnaan
FISH dikarenakan memiliki kelebihan dibandingkan dengan label radioaktif yang
cenderung labil dan berbahaya, selain itu lebih mudah dan cepat dalam mendeteksi
dibandingkan reporter imun. Banyak penelitian dalam jurnal, termasuk acuan
pustaka kami juga menggunakan metode FISH ini. Reporter FISH akan ditambahkan
pada Probe, sehingga akan ikut tertempel pada DNA target. Setelah itu dilakukan
pencucian agar sisa probe tercuci sehingga yang tertinggal adalah probe dan
reporter yang menempel pada DNA target. Kemudian hasil dideteksi menggunakan
epiflouresence microscope yang dapat mendeteksi adanya cahaya pendar dari
flouresence. Gen yang berpendar tersebut merupakan gen mutasi yang terdeteksi
adanya kanker.
Daftar Pustaka
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe
Tidak ada komentar:
Posting Komentar